Қоректік орталар

Зертханалық орталар үшін электр өткізгіштігі 2 мкСм/см-ден аспайтын дистилденген су немесе I–II тазалық дәрежесіндегі деионизацияланған су қолданылады. Құбыр және артезиан суы тек өндірістік рецептураларда (мысалы, модификацияланған Заррук ортасында) жарамды, онда судың кермектігі CaCl₂ мөлшерін азайту арқылы ескеріледі.
Олиготрофты орталарды (Chu-10, ASM-1, WC) дайындар алдында жаңа дистилденген суды 1–2 тәулік ұстайды: бұл еріген CO₂-ні кетіріп, pH-ты тұрақтандырады.
Табиғи теңіз суын жағадан алыс жерден алады, 0,45 мкм арқылы сүзеді, қараңғыда 2–4 апта ұстайды («ескіру») және 0,22 мкм арқылы қайта сүзеді. Ескіру еріген органикалық заттардың минералдануы үшін қажет.

2. Тұздарды еріту реті

Әмбебап ереже: тұздар бір-бірлеп, барынша сұйылтылған ерітіндіге енгізіледі; келесісін қосар алдында алдыңғы өлшенді толық ерітілуі тиіс. Концентрлі аналық ерітінділер бір-бірімен ешқашан тікелей араластырылмайды.
Кальций тұздары (CaCl₂, Ca(NO₃)₂) ЕҢ СОҢЫНДА — фосфаттар мен карбонаттардан кейін, қарқынды араластыра отырып, соңғы көлемнің кемінде 80 %-ы болғанда енгізіледі. Ретті бұзу Ca₃(PO₄)₂ және CaCO₃ ақ лайын береді, ол ортадан фосфор мен кальцийді қайтымсыз шығарады.
Темір тұздары тек хелаттаушымен (ЭДТА, цитрат, NTA) бірге енгізіледі: алдын ала оларды судың жеке бөлігінде араластырып, комплекс толық түзілгенше 20–30 мин ұстайды — тұнбасыз тұрақты сары түс пайда болғанша.
Силикаттар (Na₂SiO₃·9H₂O) ең соңында және тек жұмыстық pH-қа жеткізілген ортаға енгізіледі: қышқыл ортада диатомдыларға қолжетімсіз аморфты SiO₂ тұнбаға түседі.
Натрий бикарбонаты соңғы болып енгізіледі немесе жеке ерітінді түрінде дайындалады — әсіресе кальций қатар болғанда.

3. Аналық (концентрлі) ерітінділер

Орталардың көпшілігін құрғақ өлшендіден емес, ×100 … ×1000 еселіктегі аналық ерітінділерден дайындау ыңғайлы: 6 мг өлшендіні дәл өлшеу мүмкін емес, ал 6 г/л ерітіндіден 1 мл өлшеп алу оңай.
Бөлек сақтау ережесі: фосфаттар, кальций тұздары, карбонаттар және темір ерітінділері ӘРТҮРЛІ құтыларда сақталады. Оларды бір ерітіндіде біріктіру міндетті түрде тұнба береді.
Жарамдылық мерзімі: макротұздар — 4 °C-та 6–12 ай; темір ерітінділері — 3–6 ай (қоңыр тұнба пайда болғанда жаңартылады); витаминдер — −20 °C-та 6 ай.
Таңбалау міндетті: ерітінді шифры, дайындалған күні, жарамдылық мерзімі, орындаушының тегі. Ерітінділер қара түсті шыныда сақталады; пластик микроэлементтерге жарамды, бірақ ұзақ сақталатын ЭДТА ерітінділеріне жарамайды.

4. pH-ты түзету

pH барлық компоненттер енгізілгеннен КЕЙІН, бірақ зарарсыздандырудан БҰРЫН, сұйылтылған 1 М NaOH (KOH) немесе 1 М HCl ерітінділерімен жеткізіледі. Концентрлі қышқылдар мен сілтілер енгізу нүктесінде жергілікті тұнба түзеді.
Автоклавтау pH-ты ығыстырады: бикарбонаты бар орталарда (Заррук, SOT) NaHCO₃ ыдырап, CO₂ жоғалуы салдарынан 0,5–1,0 бірлікке жоғарылайды; органикалық буферлі орталарда әдетте 0,1–0,3 бірлікке төмендейді. Мақсатты мән осы ығысуды ескере отырып белгіленеді.
Буферлік жүйелер: фосфатты буфер (BBM), Трис 10–20 мМ (TAP, WC, Provasoli), HEPES 10 мМ (BG-11 модификациялары), карбонат-бикарбонатты (BG-11, Заррук). Трис пен HEPES қанттармен бірге автоклавталмайды.

5. Зарарсыздандыру

Автоклавтау: 121 °C, 1 атм артық қысым, 1 л-ге дейінгі көлемдер үшін 15–20 мин; 2–5 л үшін 25–30 мин. Уақытты асыру агардың карамельденуіне және бикарбонаттың ыдырауына әкеледі.
Стерильді сүзу (0,22 мкм мембрана) мыналар үшін МІНДЕТТІ: витаминдер, глюкоза және басқа органикалық субстраттар, бикарбонат ерітінділері, гипергалинді орталар (Джонсон ортасы), силикаты бар теңіз суы.
Бөлек зарарсыздандыру: үйлеспейтін компоненттер (бикарбонат + кальций; фосфаттар + кальций; қанттар + аминқышқылдары) жеке ыдыстарда автоклавталады және бөлме температурасына дейін толық суығаннан кейін ғана асептикалық жағдайда құйылады.
Пастерлеу (80 °C, 30 мин, 24 сағ аралықпен үш рет) — теңіз суы үшін карбонаттық тепе-теңдікті сақтайтын жұмсақ балама.

6. Агарланған орталар

Агар концентрациясы: табақшалар үшін 10–12 г/л, жартылай сұйық орталар үшін 6–8 г/л, пробиркадағы қиғаш агар үшін 15 г/л. Бактериологиялық немесе тазартылған агар қолданылады; техникалық агарда тежеуші қоспалар болады.
Агар екі есе көлемдегі суда БӨЛЕК автоклавталады, орта екі еселенген концентрацияда дайындалады және екеуі 45–50 °C-та араластырылады. Агарды фосфаттармен және кальциймен бірге автоклавтау табақшаларды бұлыңғыр етеді және колониялардың өнуін төмендетеді.
Цианобактериялар үшін агарға 0,3 г/л Na₂S₂O₃·5H₂O қосылады: тиосульфат агардың термиялық ыдырау өнімдерін бейтараптайды, олар өсуді тежейді.
Табақшалар ламинарлы бокста қақпағын төмен қаратып 20–30 мин кептіріледі және 4 °C-та қараңғыда 3–4 аптадан аспайтын уақыт сақталады.

7. Инокуляция және өсіру жағдайлары

Инокулят көлемі — орта көлемінің 5–10 %-ы; бастапқы тығыздығы 10⁵–10⁶ жасуша/мл. Тым аз инокулят лаг-фазаны ұзартады, тым көбі қоректік заттарды тез сарқады.
Жарықтандыру: коллекцияларды ұстауға 20–50 мкмоль фотондар·м⁻²·с⁻¹, жинақтаушы дақылдарға 100–200, каротиногенезді индукциялауға 500-ге дейін. Фотопериод 12:12 немесе 16:8, көптеген цианобактериялар үшін — үздіксіз жарық.
Температура: тұщы су формаларының көпшілігі үшін 20–25 °C, Arthrospira және Chlorella sorokiniana үшін 28–35 °C, термофильді цианобактериялар үшін 45–55 °C, полярлық және суық су штаммдары үшін 15–20 °C.
Коллекциялық дақылдар 4–8 апта сайын қайта егіледі. Ұзақ сақтау үшін криоконсервация (10 % ДМСО немесе 5 % метанол, −196 °C) немесе минералды май қабатының астында агарда иммобилизациялау қолданылады.

8. Тән қателіктер және олардың белгілері

Араластырғаннан кейін бірден пайда болған ақ лай — кальций фосфаты немесе карбонатының тұнбаға түсуі: тұздарды енгізу реті бұзылған немесе концентраттар араластырылған.
Қоңыр үлпектер, түбіндегі тот басқан тұнба — темірдің гидролизі: хелаттаушы жеткіліксіз, Fe ерітіндісінің мерзімі өткен немесе енгізу сәтінде pH тым жоғары болған.
Сырттай қалыпты ортада өсудің болмауы — автоклавтау кезінде витаминдердің бұзылуы, үрлеусіз жабық ыдыста көміртек көзінің болмауы немесе «азотсыз» ортадағы қалдық нитрат.
3–5 тәуліктен кейін дақылдың қоңырлануы және лизисі — буферлік сыйымдылықтың сарқылуы және фотосинтетикалық CO₂ тұтыну салдарынан pH 10-нан жоғары сілтіленуі.
Дақылдың хлорозы (сарғаюы) — азоттық немесе темірлік ашығу; азоттық ашығуда цианобактерияларда қосымша фикобилисомалардың деградациясы жүреді.

З. Рецептуралардың дереккөздері

Bischoff H. W., Bold H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. Univ. Texas Publ. 6318. 1963. P. 1–95.

Bolch C. J. S., Blackburn S. I. Isolation and purification of Australian isolates of the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa Kütz. // J. Appl. Phycol. 1996. Vol. 8. P. 5–13.

Borowitzka M. A., Borowitzka L. J. (eds.) Micro-algal Biotechnology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988. 477 p.

Castenholz R. W. Thermophilic blue-green algae and the thermal environment // Bacteriol. Rev. 1969. Vol. 33. P. 476–504.

Chu S. P. The influence of the mineral composition of the medium on the growth of planktonic algae // J. Ecol. 1942. Vol. 30. P. 284–325.

Costa J. A. V., Colla L. M., Duarte Filho P. F. Improving Spirulina platensis biomass yield using a fed-batch process // Bioresour. Technol. 2004. Vol. 92. P. 237–241.

Gorham P. R., McLachlan J., Hammer U. T., Kim W. K. Isolation and culture of toxic strains of Anabaena flos-aquae // Verh. Int. Ver. Limnol. 1964. Vol. 15. P. 796–804.

Gorman D. S., Levine R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi // PNAS. 1965. Vol. 54. P. 1665–1669.

Guillard R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates // Culture of Marine Invertebrate Animals. New York: Plenum Press, 1975. P. 26–60.

Guillard R. R. L., Ryther J. H. Studies of marine planktonic diatoms // Can. J. Microbiol. 1962. Vol. 8. P. 229–239.

Guillard R. R. L., Lorenzen C. J. Yellow-green algae with chlorophyllide c // J. Phycol. 1972. Vol. 8. P. 10–14.

Harrison P. J., Waters R. E., Taylor F. J. R. A broad spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton // J. Phycol. 1980. Vol. 16. P. 28–35.

Johnson M. K., Johnson E. J., MacElroy R. D. et al. Effects of salts on the halophilic alga Dunaliella viridis // J. Bacteriol. 1968. Vol. 95. P. 1461–1468.

Kester D. R., Duedall I. W., Connors D. N., Pytkowicz R. M. Preparation of artificial seawater // Limnol. Oceanogr. 1967. Vol. 12. P. 176–179.

Kotai J. Instructions for preparation of modified nutrient solution Z8 for algae. Publ. B-11/69. Oslo: NIVA, 1972.

Provasoli L. Media and prospects for the cultivation of marine algae // Cultures and Collections of Algae. Japan. Soc. Plant Physiol., 1968. P. 63–75.

Rippka R., Deruelles J., Waterbury J. B., Herdman M., Stanier R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. Vol. 111. P. 1–61.

Stanier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriol. Rev. 1971. Vol. 35. P. 171–205.

Tamiya H., Hase E., Shibata K. et al. Kinetics of growth of Chlorella // Algal Culture from Laboratory to Pilot Plant. Washington: Carnegie Inst., 1953. P. 204–232.

Vonshak A. (ed.) Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology. London: Taylor & Francis, 1997. 233 p.

Walne P. R. Studies on the food value of nineteen genera of algae to juvenile bivalves // Fish. Invest. Ser. 2. 1970. Vol. 26. P. 1–62.

Waterbury J. B., Watson S. W., Valois F. W., Franks D. G. Biological and ecological characterization of the marine unicellular cyanobacterium Synechococcus // Can. Bull. Fish. Aquat. Sci. 1986. Vol. 214. P. 71–120.

Zarrouk C. Contribution à l'étude d'une cyanophycée: influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthèse de Spirulina maxima. Thèse. Paris: Univ. de Paris, 1966.

Дақылдар коллекцияларының каталогтары: UTEX (Техас университеті), CCAP (Ұлыбритания), SAG (Гёттинген), CCMP/NCMA (Бигелоу), ATCC (Manassas), ANACC (Австралия), NIVA (Норвегия).